Il santuario è dedicato alla figura di Santa Margherita, patrona di Cortona e terziaria francescana, e alla successiva attività culturale e spirituale dei Francescani Osservanti. Alla morte della santa (22 febbraio 1297) si decise di costruire una chiesa in suo onore, a fianco dell'antica chiesetta di San Basilio che Margherita stessa aveva restaurato dopo averla scelta come luogo di penitenza e di preghiera.
L'interno basilicale a tre navate divise da pilastri e con volte a crociera è un piacevole ambiente eclettico, di imitazione romanico-gotica, che coniuga i rimandi all'architettura soprattutto senese, con un gusto coloristico per la decorazione vivace tipicamente ottocentesco. Sui quattro pilastri le statue di San Francesco, San Ludovico, Santa Elisabetta e Santa Chiara, di gesso imitante il marmo, sono opera di Giovanni ed Amalia Duprè.
Conservato nella cappella del transetto di sinistra (come ultimo approdo di peregrinazioni forzate per motivi di carattere architettonico) è il monumento sepolcrale di santa Margherita in marmo scolpito, opera di ambito senese con evidenti richiami a Giovanni Pisano, opera di Agnolo e Francesco di Pietro (1362).
Nell'altare a destra dell'altar maggiore si trova collocato, dopo la ristrutturazione del primo Settecento, il Crocifisso detto di santa Margherita, in quanto la tradizione locale vi riconosce quel Crocifisso di fronte al quale la santa era solita raccogliersi nella chiesa di San Francesco e che le aveva rivolto la parola. Anche gli studi più recenti confermano una tale identificazione, che porta a ritenere l'opera della seconda metà del Duecento (invece che della fine del XIII o dell'inizio del XIV secolo). Il crocifisso fu qui collocato nel 1602.
Legata ad una committenza cortonese, e precisamente a quella della famiglia Lucci il cui stemma viene giocosamente mostrato dall'angioletto a sinistra in basso, è l'importante tela dipinta nel 1602 circa da Francesco Vanni con Dio Padre, l'Immacolata Concezione e i santi Francesco, Domenico, Ludovico di Tolosa e la beata Margherita da Cortona. L'opera mostra una delle prime raffigurazioni seicentesche della beata Margherita, che forse proprio per questo suo status appare leggermente defilata rispetto agli altri santi.
