Secondo la tradizione, la chiesa fu eretta sul luogo della casa paterna di sant'Ambrogio, che vi avrebbe abitato fino al suo trasferimento a Milano come console. Accanto alla chiesa venne costruito il monasterium Sanctae Mariae de Maxima, fondato nel 353, sempre secondo la tradizione, dalla sorella maggiore del santo, Marcellina. Il nome deriverebbe o da un'altra fondatrice, Massima appunto, o più probabilmente dalla vicinanza allo sbocco della Cloaca Massima nel Tevere.

La chiesa fu ricostruita più volte, ma le fonti non chiariscono le date. Nel Quattrocento o intorno al 1500 sarebbe stata unita all'adiacente chiesa di Santo Stefano e dedicata nuovamente a sant'Ambrogio. Tra il 1606 e il 1634, su commissione dei fratelli Beatrice e Ludovico de Torres, monaca benedettina l'una e cardinale l'altro, venne riedificata da Orazio Torriani e Carlo Maderno incorporando i resti dell'edificio precedente.

Dopo il 1870 chiesa e monastero furono espropriati dallo Stato italiano, ma in seguito la chiesa ed una parte del convento furono restituiti ai Benedettini. Sono attribuiti ad Antoniazzo Romano i resti di un affresco della Deposizione con le Suore Benedettine offerenti collocato nel refettorio dei monaci. Nei sotterranei della chiesa si possono visitare i resti della presunta casa di sant'Ambrogio.