L'acquario è disposto su due piani e si organizza in nove sale espositive che contengono diciassette vasche, di cui sette panoramiche, con una capienza che va da duemila a ventimila litri per un totale di circa cinquantamila litri d'acqua marina.
Le principali vasche dell'acquario intendono rappresentare diversi ambienti e piani litorali: il circalitorale superiore, con spugne, gorgonia rossa, crostacei come l'aragosta, molluschi come la vacchetta di mare, echinodermi come la stella gorgone e il riccio di mare; l'infralitorale inferiore, che ha come abitatori il sarago pizzuto e il sarago maggiore, il dentice, la spigola, lo scorfano nero e il paguro; l'infralitorale superiore, con le salpe, i cavallucci marini, varie specie di Labridi, le donzelle, le donzelle pavonine, la pinna comune e la murena; l'ambiente di superficie, illustrato in due vasche con molluschi, salpe, isopodi, anemoni, castagnole, bavose, ricci di mare, spugne e gamberi; l'ambiente pelagico, popolato dalla ricciola, dalla palmita, dai barracuda mediterranei e dallo squalo pinna nera, si tratta della vasca più grande dell'acquario (più di 4 metri d'altezza e 20000 litri di capienza) ed è situata metà al piano terra e metà al piano superiore.
Oltre a queste vasche principali, sono situate nell'acquario altre piccole vasche tematiche, che ospitano numerosi pesci come i gattucci di mare, i cavallucci, le murene, i pesci ago. Una vasca ricostruisce l'ambiente della grotta sottomarina, mentre altre quattro vasche ospitano polpi, donzelle, saraghi, aragoste e magnose. Nell'aprile 2013 è stata inaugurata una vasca tropicale, l'unica dell'acquario che non incentrata sul mar Mediterraneo, che ricostruisce l'ambiente con coralli tropicali ed alcune specie di abitatori delle barriere coralline, tra cui i noti pesci pagliaccio.
L'acquario di Porto Santo Stefano espone anche una mostra fotografica con foto subacquee realizzate da Massimo Barlettani e Alessandro Tommasi dell'Accademia Mare Ambiente, ed in più una mostra permanente delle conchiglie, situata al piano superiore, con più di cento specie diverse di conchiglie provenienti da tutto il mondo.
