L'interno ha forme gotiche, con un impianto a croce latina, tre navate divise da pilastri ottagonali e una copertura a volte a crociera costolonate. L'ampio presbiterio fu costruito nel 1517 da Arduino degli Arriguzzi e restaurato nel 1904 da Alfonso Rubbiani.
I pilastri sono decorati da affreschi votivi di santi, in parte opera di Giulio e Giacomo Francia. Le due vetrate della facciata, tra cui quella del grande rosone centrale, sono del 1467-1481, eseguite dai fratelli Cabrini su disegno di Francesco del Cossa.
Al centro della navata principale si trova un grande croce dall'antica chiesa, poggiante su un capitello romano rovesciato. L'altare adiacente è decorato da un Cristo alla colonna in legno di fico, attribuito a Giovanni Angelo e Tiburzio del Maino.
Le navate laterali si allargano in numerose cappelle laterali. Da destra, in senso antiorario, un Noli me tangere di Girolamo da Treviso; nella seconda la Crocifissione tra i santi Pietro e Matteo di Bartolomeo Cesi; nella terza il Martirio di san Lorenzo di Pietro Faccini (1590); la quarta non ha decorazioni di rilievo, mentre la quinta presenta un Sant'Aniano di Benedetto Gennari junior; nella sesta un affresco frammentario della Madonna col Bambino di Lippo di Dalmasio (inizio del XV secolo); la settima infine, alla testata del transetto, ha la grande pala della Madonna in trono e santi di Lorenzo Costa (1497).
Nel coro un'altra pala di Lorenzo Costa, l'Incoronazione della Vergine (1501). Il coro intarsiato è opera del 1518-1523 di Paolo Sacca, decorato da busti in terracotta di Zaccaria Zacchi da Volterra. La parete sinistra è decorata da un Crocifisso su tavola dello pseudo Jacopino (inizio del XIV secolo), mentre quella destra ha la Natività della Vergine di Cesare Aretusi e Giovan Battista Fiorini (1580 ca.).
La cappella alla testata del transetto sinistro fu commissionata ad Arduino degli Arriguzzi da Elena Duglioli dall'Olio nel 1514-16. Qui si trovava la celeberrima pala dell'Estasi di santa Cecilia (1518) di Raffaello, oggi rievocata da una copia di Clemente Alberi del 1860-61; la tavola è però tuttora contornata dalla cornice lignea originaria. Sul sarcofago, quattro angeli reggi-cero in legno dorato anch'essi attribuiti ai fratelli Del Maino.
Nella navata sinistra, sempre procedendo in senso antiorario, si incontrano una pala di Francesco Gessi, una copia dell'Annunciazione di Guido Reni dell'allievo Ercole de Maria (quarta cappella) e il monumento al medico Giovanni Tosino (1527, tra terza e seconda cappella, dove si trova anche la porta alla scalinata voltata che immette in via Santo Stefano, fiancheggiata da varie memorie funebri da pavimento della chiesa). Nella seconda cappella, di deliziosa architettura barocca, tre tele del Guercino (1645) vengono illuminate da un effetto di luce proveniente dall'alto: San Francesco che adora il crocifisso, San Girolamo e Santa Maria Maddalena.
