Le catacombe sono sorte verso fine del II secolo, con alcuni ipogei cristiani privati e da un'area funeraria direttamente dipendente dalla chiesa romana. Prendono nome dal diacono Callisto I, preposto da papa Zefirino all'amministrazione del cimitero stesso. Salito a sua volta al soglio pontificio, Callisto ingrandì il complesso funerario, che ben presto divenne quello ufficiale della Chiesa.

Le gallerie, dove trovarono sepoltura più di cinquanta martiri e sedici pontefici, fanno parte di un complesso cimiteriale che occupa quindici ettari e raggiungono una lunghezza di quasi venti chilometri. I nuclei più antichi sono le cripte di Lucina e la regione detta dei Papi e di Santa Cecilia, dove si conservano alcune tra le memorie più sacre del luogo (le cripte dei Papi e di Santa Cecilia, e i cubicoli dei Sacramenti); le altre regioni sono denominate di San Gaio e di Sant'Eusebio (della fine del III secolo), Occidentale (risalente alla prima metà del IV secolo) e Liberiana (della seconda metà del IV secolo), con grandiose architetture sotterranee.

Una scala moderna, fatta costruire sul posto di quella antica di papa Damaso I, dà accesso alla regione dei Papi, in cui si visita l'omonima cripta, dove furono sepolti nove pontefici e, forse, otto esponenti della gerarchia ecclesiastica: lungo le pareti sono le iscrizioni originali in greco dei pontefici Ponziano, Antero, Fabiano, Lucio I e Eutichiano. Nella parete di fondo fu deposto anche papa Sisto II, ucciso durante la persecuzione di Valeriano. L'iscrizione metrica dinanzi al sepolcro di papa Damaso è incisa nei caratteri ideati dal calligrafo Furio Dionisio Filocalo.