Si tratta di un piccolo ambiente, oggi comunicante con il Salone dei Cinquecento, dove il granduca Francesco I de' Medici amava ritirarsi in solitudine coltivando i propri interessi scientifici e magico-alchemici. Lo studiolo in particolare doveva essere una sorta di Wunderkammer, luogo dove catalogare i più vari materiali collezionati da Francesco, mentre gli esperimenti veri e propri si svolgevano nel laboratorio del Casino di San Marco (lo studiolo infatti non ha nemmeno una finestra).
Nell'agosto del 1570 Vincenzo Borghini, intellettuale della corte medicea, dettava al Vasari il programma di decorazione di una stanza di Palazzo Vecchio, adiacente anche alla camera da letto di Francesco I e comunicante con lo Studiolo di Cosimo I, padre di Francesco, anche questo un piccolo ambiente segreto.
Fu quindi completato tra il 1570 e il 1572 da un gruppo di artisti supervisionati da Giorgio Vasari e dal suo discepolo Giovan Battista Adriani.
Fu però smantellato nel 1590, non molto tempo la scomparsa del granduca (1587), che presto l'aveva abbandonato in favore di Pratolino: le pitture che lo decoravano vennero disperse tra le varie raccolte di opere d'arte della città: gli Uffizi, Palazzo Pitti, ecc. Nel 1920 si decise di ripristinare questo ambiente, ricreando il pavimento e i pannelli lignei sui quali sono poggiate le pitture (in realtà ciascun pannello copre un armadio o una porta). Le pitture sono state ricollocate basandosi sui temi degli affreschi sulla volta, dove sono rappresentati i quattro elementi. All'epoca del riallestimento mancarono due pannelli, non si sa se dispersi o mai realizzati. L'unica parte originale è quindi la zona del soffitto, ma l'insieme comunque ancora oggi di grande suggestione.
Contribuirono alla decorazione dello studiolo numerosi scultori dell'epoca. Stoldo Lorenzi, Vincenzo Danti, Giovanni Bandini, Elia Candido, Giambologna, Vincenzo de' Rossi, Domenico Poggini, Bartolomeo Ammannati e Niccolò di Gerardo. Tra i pittori si trovano: Alessandro Allori, Andrea del Minga, Domenico Buti, Giovanni Maria Butteri, Vittore Casini, Mirabello Cavalori, Jacopo Coppi, Alessandro Fei, Maso da San Friano, Santi di Tito, il Vasari e altri.
